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原代細胞培養不好?——這些問題,你注意到了嗎?

版權所有,轉載請聯系基因市場部
2021-09-03

原代細胞狀態不好,長不起來怎么辦?哎,下次匯報我沒有什么新的結果怎么辦!不知道為何細胞長著長著就變樣了呢?是否有過類似的情況?

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原代細胞培養的流程大致包括:細胞復蘇、傳代培養及凍存。即使你經驗豐富,也可能會忽視某些方面。若稍有不慎,就會出現細胞不健康,甚至死亡的后果。今天小編就帶大家看看原代細胞培養中一些容易忽略的問題。

“不希望你的原代細胞脾氣暴躁,那就要注意這些問題”

?? 這里有個非常關鍵的問題--準備!確保你準備好了你需要的一切。

例如,是否準備好無菌移液管和槍頭等,并且已經將特定培養基預熱。說到預熱:你最近有用水銀溫度計或酒精溫度計檢查過水浴鍋溫度嗎?還是你盲目地相信顯示器上的數字呢?事實證明,這往往是導致致命后果的主要原因之一。如果溫度高于37°C,細胞將受到影響。如果溫度太低,解凍時間就太長,細胞將會受到不可逆轉的損傷。

?? 做好充分準備后,就到了第二個關鍵點--時機!

你只有五分鐘的時間將細胞從液氮中取出,解凍,最后將其轉移到培養箱中--時間不多,尤其是要把細胞豎直放在水浴鍋中1-2分鐘解凍--不要用漂浮物固定。所以需要快,同時,要對細胞溫柔,不要劇烈的上下顛倒移動。有個非常生動的比喻:原代細胞就像人類一樣。如果你試著輕輕地撫摸它們來喚醒它們,它們最終會起床--但它們上班會遲到。另一方面,如果你用力搖晃它們,它們會很快醒來--但會整天脾氣暴躁。這就需要我們在速度和溫柔之間取得良好的平衡。此外,要注意保持水浴鍋清潔,不然細胞很容易污染。

“幸福的密度--必須注意的問題”

?? 當細胞密度為70-90%時,這是細胞傳代培養的理想時機。

細胞需要周圍的朋友才能快樂--不是太少,也不是太多。同樣,這和人類一樣--我們大多數人在擁擠的地方會感覺不舒服。此外,與大多數細胞系相比,一些原代細胞在達到完全融合時就會發生分化,所以傳代時細胞密度的控制非常重要。

?? 在培養瓶中選擇合適的細胞密度可以帶來雙贏的局面,你可以擁有大量的細胞。同時,選擇合適的胰蛋白酶和終止液對細胞消化解離非常重要。

胰蛋白酶的濃度非常關鍵,市面上銷售的胰蛋白酶濃度大多數為0.05%或更高,可能會損害原代細胞。建議使用0.04%胰蛋白酶/0.03%EDTA溶液對正常人細胞進行傳代培養,對細胞損傷小。

有人問:能用生長培養基來終止胰蛋白酶嗎?一般需要使用濃度>10%的FBS來完全滅活胰蛋白酶,但原代細胞培養基大多是低血清或無血清的,如果加入高濃度血清來終止胰蛋白酶會影響后續細胞培養,因此強烈建議使用不含血清的胰蛋白酶抑制劑。

“讓你的原代細胞醒來充滿活力—凍存不得不說的問題”

?? 許多實驗室都有自己的凍存細胞方案,通常需要使用含有高濃度血清和二甲基亞砜的培養基,但是要知道血清中含有很多未知因素。

由于原代細胞對刺激反應強烈,血清會通過觸發不受控制的信號通路來影響它們,此外,高濃度的DMSO也會損傷細胞。為了彌補這一點,你需要在開始培養前通過離心來清洗細胞--這同樣會給你的細胞帶來刺激。建議使用無血清,DMSO濃度非常低的凍存液,以利于提高細胞復蘇后的活力。

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