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NanoDrop A280法直接進行純化蛋白的準確定量評估

版權所有,轉載請聯系基因市場部
2021-09-02

NanoDrop One/Onec 超微量紫外-可見分光光度計具有多種預編程的蛋白質應用,包括蛋白質A280、蛋白芯片、蛋白質A205 和比色分析(如Bradford、BCA、Lowry和Pierce 660),使生命科學家能夠量化蛋白質樣品(圖 1)。本文主要介紹了NanoDrop One 超微量分光光度計在使用蛋白質A280應用測量牛血清白蛋白 (BSA) 制劑時的性能。通過與Thermo Scientific Evolution 300 紫外-可見分光光度計測量值進行比較,在儀器的動態范圍內對NanoDrop One A280法直接測定純化蛋白的準確性進行評估,結果表明NanoDrop One 超微量分光光度計在廣泛的蛋白質濃度范圍內具有高度的準確度和出色的線性。

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圖1:NanoDrop One蛋白測定界面。

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 NanoDrop One 超微量分光光度計可以準確定量濃度范圍為 0.06 mg/mL 至 820 mg/mL 的BSA標準品(即吸光度介于 0.04A 和 550A 之間)的純化蛋白質制劑。NanoDrop One 獲得專利的樣品滯留系統和自動調整光程長度使用戶無需稀釋、無需昂貴的耗材即可測量大范圍的濃度。通過將NanoDrop One獲得的蛋白質測量值與基于比色皿的臺式Thermo Scientific Evolution 300 紫外-可見分光光度計測量值進行比較,對NanoDrop One的準確性在儀器的動態范圍內進行評估。

 

首先,用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 稀釋BSA標準溶液 (Sigma Aldrich, #A7284) 來制備一系列0至290 mg/mL的溶液。然后,使用Evolution 300分光光度計1cm石英比色皿 (Starna Cells, 1-Q-10) 測量280 nm處的吸光度來驗證BSA濃度。超出Evolution 300分光光度計吸光度檢測限的樣品用PBS稀釋,并根據需要再次測量。通過吸光度值用于手動計算未稀釋 BSA溶液的濃度。接著,在NanoDrop One上使用A280法直接測定相同樣品濃度,用 PBS 溶液做空白,每次重復測量使用新的2 μL BSA溶液至基座上。最后,對2臺儀器測量的數據進行比較來評估NanoDrop One A280法直接測定純化蛋白的準確性。

 

為了計算每個樣品的濃度,NanoDrop One 軟件使用在280 nm 處測得的吸光度和 6.7的質量消光系數來計算蛋白質濃度。分別給出 Evolution 300 和 NanoDrop One 超微量分光光度計的平均濃度、標準偏差和變異系數值(表 1),然后繪制并分析這些值來進行比較(圖 2 和圖 3)。

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表1:分別在 NanoDrop One 和 Evolution 300 上測量了9種不同濃度的 BSA 制劑,每個濃度測10次重復。


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圖 2:繪制了最終的 BSA 濃度,并比較了 NanoDrop One 和 Evolution 300 分光光度計之間的線性度?;貧w線表明在兩種儀器上獲得的蛋白質濃度之間存在很強的相關性。


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圖 3:繪制了 NanoDrop One 和 Evolution 300 低濃度范圍內的計算濃度,并比較了線性。NanoDrop One 在低濃度范圍內觀察到出色的線性。

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NanoDrop One超微量分光光度計Evolution 300分光光度計上測定的相同樣品的數值進行分析比較,表明NanoDrop One 超微量分光光度計在廣泛的蛋白質濃度范圍內具有高度的準確度和出色的線性。圖2測試的全范圍的蛋白質濃度以及圖3測試的低濃度范圍的蛋白質濃度,進行比較分析表明NanoDrop One測試計算的R2值與Evolution 300獲得的參考值具有很強的相關性。同時,在整個操作流程中,NanoDrop One上樣體積較小,只需1-2μL樣品即可。另外,NanoDrop One具有創新的自動量程光程長度技術及獨特的測量基座和寬動態范圍,因此對高濃度的樣品也可以直接進行檢測,無需稀釋,無需昂貴的耗材。再加上易于使用的預置方法和集成的 Android平板電腦進一步簡化了蛋白質濃度檢測工作流程,從而使樣品測量更加簡便、快速、經濟實惠。

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專利號:Patents US6628382 and US6809826


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